אני מנסה להבין את גודל השפעות האצווה בדגימות ה- RNA-seq שלי, ותהיתי אילו יחידות ביטוי מתאימות יותר לציור PCA. אני חושב על ספירות או TPM , אבל דברים כמו rlog או vst יכול לעבוד גם.
בנוסף, אני תוהה אם צריך לבצע טרנספורמציה של אחת מהיחידות האלה כדי למנוע תמלילים בשפע רב שמניעים את ה- PCA.
tldr: ספירת טרנספורמציית יומנים ו- TPM, אך עדיף rlog / vst
יש לשנות טרנספורמציה של TPM כדי לקבל תוצאות שימושיות יותר. אם אתה כבר משתמש ב- DESeq2 (בהתחשב בהפניה ל- rlog ו- vst , זה נראה סביר), אנא המשך והשתמש ב- rlog או vst . זה ייתן לך תוצאות סבירות יותר מספירות גולמיות. אם אתה תקוע בספירות מסיבה כלשהי, אז ראשית השתמש בספירות מנורמלות כך שיהיו לפחות קצת יותר דומות ואז התחבר לשנות אותם כך שהגנים שלך לידי ביטוי גבוה לא יניעו הכל.
ערוך : כצידה, אם אתה יודע מה אפקט האצווה (למשל, תאריך הכנה לספריה), לפעמים נוח לכלול את זה במודל שלך. לאחר מכן תוכל להעריך את הגנים שמשתנים בפועל עקב כך, שלעיתים שימושי לדעת (למשל, אילו גנים עשויים להיות פחות או יותר מועדים להתכלות).
PCA פועל בצורה הטובה ביותר כאשר נתוני הקלט מופצים כרגיל בכל מימד. זה יהיה רעיון טוב לעשות כמה בדיקות איכות נתונים ראשוניות כדי לוודא שזה המקרה (ולהפוך את הנתונים כראוי אם לא), או לפחות לוודא שהנתונים מופצים כרגיל במצטבר.
לצורך התבוננות בנתוני אילומינה RNASeq, מה שעבד הכי טוב עבורי (כלומר ייצר את הנתונים הנראים הכי נורמליים) היה הצעדים הבאים:
צעדים אלה מפורטים מעט יותר בפירוט בעיתון Th2 שפורסם בסוף השנה שעברה:
http: // jem .rupress.org / content / early / 2016/12/01 / jem.20160470 # materials-Methods